研究背景

益生菌通过维持肠道微生物群稳定和缓解疾病症状，为宿主带来健康益处。罗伊氏粘液乳杆菌（Limosilactobacillus reuteri）是一种典型益生菌，具有多种益生特性，推测其基因组中存在许多重要功能基因，因此有必要在基因组水平上进行分析。Kong等通过全基因组测序证明猪源罗伊氏粘液乳杆菌TPC32具有治疗肠道炎症的生物学功能和治疗潜力。Morita等通过罗伊氏粘液乳杆菌和发酵乳杆菌的比较基因组分析，揭示罗伊氏粘液乳杆菌含有产生罗伊氏素和钴胺素的基因簇，是一种适应性进化的结果，有助于罗伊氏粘液乳杆菌益生菌特性的产生。Saulnier等通过比较不同来源（母乳、胃肠道和口腔）的罗伊氏粘液乳杆菌，表明功能基因的表达及其代谢途径的激活可能促进菌株在不同的环境中生长。由此可见，基因组测序和比较基因组分析有助于全面表征菌株的遗传特征，揭示不同物种的进化关系和基因差异。

方法

1.全基因组测序与分析

提取菌株AR673的基因组DNA，测量提取的总DNA的数量和质量。采用高质量DNA构建DNA文库，对文库进行测序、三代序列组装，最终得到完整的染色体序列。生物信息学分析：对基因组中的tRNA和rRNA进行预测，利用Swiss-Prot数据库、NR数据库、GO、Pfam数据库、COG、和KEGG数据库6大数据库分别进行比对，对预测的蛋白质编码序列进行功能标注。通过Circos软件绘制单个样本基因组圈图。以乳酸菌的16S rRNA基因序列为基础，构建系统发育树。

2.比较基因组分析

采用BLASTN对乳酸菌菌株进行全基因组比较。采用CD-HIT相似蛋白快速聚类软件对核心基因和特异基因进行分析。利用Hcluster_sg软件对比对结果进行基因家族聚类处理，进行37个基因组同源性比较。采用整合原核生物基因组和泛基因组分析（IPGA）平台进行平均核苷酸一致性（ANI）分析。利用碳水化合物活性酶数据库分析37株菌的碳水化合物活性酶，使用在线云平台chiplot绘制CAZymes热图。采用antismash软件对菌株的次级代谢产物的合成基因簇进行比较。

结果

AR673全基因组信息分析结果是，COG（图3）和KEGG数据库分别注释到1 656个（图3）和1 226个基因（图4）。其中，功能注释基因以代谢、遗传信息进程和环境信息进程通路中注释的基因最多。环境信息进程通路中只有2类，基因数量最多的是膜转运；遗传信息进程通路中功能基因主要定位于翻译；代谢通路中基因数量最多的为碳水化合物代谢、辅因子和维生素的代谢和氨基酸代谢通路。AR673具有高达112个基因的碳水化合物代谢注释量，表明该菌株可能在糖类分解和代谢功能中具有菌株优势。抗应力分析发现罗伊氏粘液乳杆菌AR673含有一系列编码温度、pH值、胆盐、渗透压、氧化等应激蛋白的基因（表2）。由此推测AR673可能具有耐酸、温度胁迫、胆盐胁迫、抗氧化的等特性，可能预示AR673在发酵工业中具有优势。

泛基因组分析结果显示，37株罗伊氏粘液乳杆菌的泛基因组呈开放型状态，数量为5 066个，可分为1 190个核心基因组（23.49%）以及1 167个菌株特异性基因（图6）。37株菌株间菌株特异基因数量差异较大，菌株特异性基因的数量从仅在19-E-6、19-E-3、VHProbi E18、VHProbi M07中发现的0个基因簇到LL17所特有的173个基因簇不等，可能与不同寄主生存环境的差异有关。

罗伊氏粘液乳杆菌的泛基因组的拟合曲线（图7），随着菌株数量的增加呈上升趋势，这可能是由于其在自然界中分布广泛，与外界各种遗传物质发生交换，说明该物种有较高的遗传多样性，且具有对周围环境和宿主的适应性。其核心基因的数量随菌株数量增加逐渐趋于稳定，说明该物种的稳定性较高。37株罗伊氏粘液乳杆菌的特异性基因数量有差异可能与其生长环境和代谢特性有关。

碳水化合物活性酶分析结果显示，罗伊氏粘液乳杆菌可注释到的CAZymes为4类：GH、GT、AA和CMB（图8）。最普遍的CAZy分类为GH、GT。说明罗伊氏粘液乳杆菌有较高的糖、纤维素的合成能力，丰富的GHs表明其对宿主来源的碳水化合物的利用能力。

通过次级代谢产物分析，发现不同的罗伊氏粘液乳杆菌的次级代谢产物基因簇不同。主要预测到细菌素（Bacteriocin）、聚酮合酶（PKS）、和非核糖体肽合酶（NRPS）等次级代谢产物。其中，罗伊氏粘液乳杆菌Byun-re-01、I49、LL17、SKKU_OGDONS_0、FN041均含有细菌素合成基因簇，罗伊氏粘液乳杆菌FN041含有2个细菌素合成基因簇。罗伊氏粘液乳杆菌YLR001含有1个非核糖体肽合酶（NRPS）产生基因簇。37株菌均含有一个III型聚酮化合物合酶合成基因簇，能合成聚酮类化合物，可用于研制抗生素、抗菌剂等。次级代谢产物的分析为解释罗伊氏粘液乳杆菌的抗菌活性提供了更有效的依据。

  结论

本研究以罗伊氏粘液乳杆菌AR673为例，通过全基因组测序和比较基因组分析了罗伊氏粘液乳杆菌的基因组特征、系统发育进化和可能存在的益生功能。COG和KEGG结果表明AR673可能具有巨大的翻译、核糖体结构和生物发生的潜力；在糖类分解和代谢功能中具有菌株优势。对抗应力情况的研究显示，AR673可能具有耐酸、温度胁迫、胆盐、氧胁迫的特性。37株罗伊氏粘液乳杆菌基因组比较分析显示，罗伊氏粘液乳杆菌泛基因组呈开放型。次级代谢系统比较发现，37株菌共注释到4类CAZymes，3种次级代谢产物。碳水化合物酶主要注释到GH、GT家族，次级代谢产物中聚酮合酶、细菌素占多数。综上所述，罗伊氏粘液乳杆菌AR673是一株具有多种益生功能的菌株，为后续罗伊氏粘液乳杆菌在食品工业中的开发和应用提供了参考。

原文链接：https://kns.cnki.net/kcms2/article/abstract?v=mg_qcPBBapmbg71xWSJLk3UbkIfV_BmHxGA7Ws3GbKxirTXNrsNGfTvy3TA29EPYcgq0UZ8z70EfkSgGtaOWC-DKIs6LzwTXB7sIpPnaxlpggz7SEPLY74ZO_fpVZmnlmY8Q71atvvGqMcz0GF1n0aeHddLSiBj8D3g3qEGqKEiP9VhlME2ITQ==&uniplatform=NZKPT&language=CHS